Ketika Patrick Yizhi Cai merefleksikan keadaan genomika sintetis, dia mengingat Kontes DNA Besar. Diluncurkan pada tahun 2004, kompetisi ini menantang para ahli biologi sintetis untuk merancang urutan DNA 40.000 pasangan basa yang baru dan fungsional yang akan diproduksi secara gratis oleh sponsor kontes, yaitu perusahaan sintesis DNA Amerika Serikat, Blue Heron Biotech (sekarang Eurofins Genomics Blue Heron).
Itu bukanlah hadiah yang kecil: pada saat itu, memproduksi lempengan DNA yang sederhana ini – kurang dari 1% panjang genom Escherichia coli – akan menelan biaya sekitar US$250.000. Tujuan perusahaan ini adalah untuk memberi energi pada bidang biologi sintetis yang saat itu masih baru. “Pada akhirnya, tidak ada satu pun aplikasi yang diterima,” kata Cai, seorang ahli biologi sintetis di University of Manchester, Inggris. “Hal ini menunjukkan bahwa meskipun Anda dapat membuat DNA sintetis secara gratis, tidak ada yang benar-benar memiliki imajinasi yang cukup pada 20 tahun yang lalu.”
Saat ini, kemajuan yang stabil dalam genomik dan biologi komputasi – belum lagi sintesis dan perakitan DNA – telah menghasilkan banyak contoh tentang apa yang dapat dicapai oleh upaya penulisan genom yang ambisius dan imajinatif. Strain bakteri sintetis JCVI-syn3A, yang dikembangkan di J. Craig Venter Institute (JCVI) di La Jolla, California, adalah versi ramping dari Mycoplasma mycoides yang bertahan dan bereplikasi meskipun telah menghilangkan beberapa ratus gen yang tidak penting1. Berbagai kelompok sedang merekayasa strain E. coli yang kode genetiknya telah diubah untuk memungkinkan produksi protein yang mengandung asam amino di luar 20 asam amino yang biasa ditemukan di alam. Dan tahun lalu, Proyek Genom Ragi Sintetis multinasional (Sc2.0) menyelesaikan konstruksi versi rekayasa berat dari setiap kromosom dalam ragi tunas eukariotik, Saccharomyces cerevisiae – yang terdiri dari sekitar 12 juta pasangan basa secara keseluruhan.
Upaya ini merupakan pengalaman belajar yang sangat berharga, kata Akos Nyerges, seorang peneliti genomika sintetis yang terlibat dalam upaya penulisan ulang E. coli di laboratorium George Church di Harvard Medical School di Boston, Massachusetts. “Anda bisa meniru dan menguji langkah-langkah evolusi yang jika tidak, akan membutuhkan waktu miliaran tahun untuk berevolusi – atau bahkan tidak akan berevolusi sama sekali,” katanya. Namun, penelitian ini juga menyingkap betapa kita masih belum memahami bahasa dasar genom. Setiap program penulisan ulang genom sejauh ini telah bergulat dengan tantangan yang substansial dan tak terduga, dan era genom yang dibuat sesuai pesanan masih berada di luar jangkauan. Ketika berbicara tentang genom yang dimodifikasi secara besar-besaran, kata Nyerges, “kita meremehkan betapa kompleksnya biologi”.
Kembali ke dasar
Sebagian besar proyek genom sintetis merupakan upaya ‘top-down’ yang mengambil organisme alami dan mengupas atau mendesain ulang DNA-nya. Hal ini memberikan kerangka kerja awal yang berharga dibandingkan dengan pendekatan ‘bottom-up’, di mana tujuannya adalah membangun genom yang berfungsi dari awal. Lagi pula, jelas Farren Isaacs, seorang insinyur genom di Universitas Yale di New Haven, Connecticut, ketika mengutak-atik genom, margin kesalahan sangat kecil. “Jika Anda membuat kesalahan pada gen yang penting, Anda akan memusnahkan organisme tersebut.”
Tujuan utama dari proyek JCVI dan Sc2.0 adalah untuk menentukan gen mana yang benar-benar esensial – sebuah karakteristik yang ternyata sulit diprediksi. John Glass, pemimpin program biologi sintetis JCVI, mengatakan bahwa ketika ia dan timnya mempublikasikan2 laporan tahun 2016 tentang sel minimal pertama mereka, hampir sepertiga dari gen-gen yang tersisa (149 dari 473) tidak memiliki fungsi yang diketahui. “Saya akan mengatakan bahwa sekarang jumlahnya 78,” tambahnya.
Untuk menentukan gen mana yang diperlukan, kedua proyek tersebut menggunakan mutagenesis acak – pada dasarnya, memperkenalkan gangguan yang tidak ditargetkan di seluruh genom dan menanyakan mana yang dapat ditoleransi oleh sel dan mana yang sangat merusak kelangsungan hidup sel.
Namun, esensialitas adalah konsep yang licin, terutama mengingat bahwa sebagian besar genom mengandung redundansi dan mekanisme ‘gagal-aman’ untuk meminimalkan dampak mutasi individu. Glass dan rekan-rekannya menemukan lusinan contoh di mana mutagenesis mengungkapkan pasangan gen yang tampaknya berbeda yang secara tak terduga menjalankan fungsi yang tumpang tindih. Hasilnya, tidak ada genom minimal, jelasnya. “Anda menghilangkan satu [gen], dan dengan setiap pilihan, Anda akan menempuh jalan yang berbeda menuju sel minimal yang sedikit berbeda.” Selain itu, banyak gen bakteri yang memiliki banyak tugas, sehingga sulit untuk mengenali mana yang merupakan fungsi penting. Glass mengutip contoh enolase, sebuah enzim dengan peran terkenal dalam metabolisme karbohidrat yang ternyata juga membantu mendegradasi RNA yang tidak diinginkan.
‘Model sel utuh’ komputasi yang semakin canggih dapat membantu menghilangkan beberapa dugaan dari upaya pemangkasan genom di masa depan. Pada tahun 2020, ahli matematika Lucia Marucci dan ahli biologi sintetis Claire Grierson, keduanya dari Universitas Bristol, Inggris, memimpin upaya untuk mensimulasikan strategi pengurangan genom dalam model sel utuh Mycoplasma genitalium – kerabat dekat mikroorganisme yang disunting oleh JCVI3. Analisis mereka, yang menggunakan model rumit proses seluler dan interaksinya, menyarankan dua desain ulang dengan set gen yang berbeda yang dihapus, masing-masing menghasilkan genom yang kira-kira 40% lebih kecil dari genom M. genitalium alami.
Baru-baru ini, Marucci dan Grierson telah mulai bekerja dengan model sel utuh E. coli yang canggih. Seperti yang dijelaskan dalam pracetak 20244, upaya mereka saat ini menggabungkan model mekanistik dengan pembelajaran mesin untuk memprediksi konsekuensi manipulasi genom di berbagai fungsi biologis. Hal ini dijelaskan oleh ribuan persamaan yang saling terkait, menghasilkan cetak biru untuk bakteri yang memiliki gen 40% lebih sedikit daripada E. coli tipe liar. “Kami sekarang memiliki banyak genom yang diperkecil yang ingin kami uji di laboratorium,” kata Marucci.
Menemukan dan mengganti
Alih-alih membuat edisi ringkas dari genom, kelompok lain telah berupaya menyusun ulang teks genetik secara halus – menghadapi tantangan yang sama sekali berbeda.
Urutan pengkodean protein dibangun dari triplet nukleotida yang dikenal sebagai kodon. Dengan 61 kemungkinan kodon untuk 20 asam amino yang terjadi secara alami serta 3 kodon ‘penghenti’ yang menghentikan sintesis protein, terdapat banyak sekali redundansi dalam kode yang dihasilkan. Berbagai tim telah menunjukkan bahwa, dengan mengubah secara komprehensif setiap contoh kodon yang diberikan menjadi salah satu ‘sinonimnya’, seseorang dapat menggunakan kembali kodon tersebut. Bulan ini, misalnya, Isaacs dan rekan-rekannya mendeskripsikan strain E. coli yang disebut Ochre di mana dua kodon berhenti ditugaskan kembali untuk mengarahkan penggabungan asam amino non-alami para-asetil-l-fenilalanin dan Nε-Boc-l-lisin5. Asam amino ini memiliki sifat dan fungsi kimiawi yang tidak ada di alam, tetapi pengodean ulang juga dapat berfungsi sebagai ‘firewall’ yang mencegah interaksi dan pertukaran materi genetik dengan organisme lain di lingkungan alami.
Pekerjaan tersebut mungkin terdengar mudah – hanya mengganti satu kodon dengan kodon lainnya – tetapi pengodean ulang genom membutuhkan banyak perencanaan dan usaha. Setelah para peneliti menemukan semua contoh kodon yang ingin mereka hilangkan, mereka kemudian harus mencari cara untuk menggantinya tanpa mengganggu gen atau mesin pengatur yang terpengaruh. Gen bakteri sering kali mengandung urutan pengaturan dalam urutan pengkodean protein, Nyerges menunjukkan, dan gen pada satu untai DNA dapat tumpang tindih dengan gen pada untai yang berlawanan. Perubahan yang tampaknya kecil dapat memiliki konsekuensi yang besar dan tak terduga.
Nyerges, Church, dan rekan-rekannya bergulat dengan tantangan ini dalam skala yang belum pernah terjadi sebelumnya ketika mereka menyelesaikan varian E. coli yang sangat dikodekan ulang yang hanya menggunakan 57 dari 61 kodon asam amino yang terjadi secara alami6. Upaya ini telah melibatkan lebih dari 73.000 perubahan pada genom 4-megabase strain, yang pasti menciptakan efek yang tidak diinginkan. “Beberapa hal akan terjadi dengan mudah tanpa berdampak pada pertumbuhan atau kebugaran, sementara yang lain memiliki dampak yang mencolok,” kata Nyerges. Beberapa perubahan menonaktifkan elemen regulasi yang ada atau tanpa disadari menciptakan yang baru; yang lain membentuk urutan pengkodean protein baru. “Dan kami hanya belajar tentang hal ini sambil berjalan.”
Memilah-milah masalah ini adalah pekerjaan yang sangat penting. Sebagai contoh, selama proses pengodean ulang untuk strain Ochre mereka, Isaacs dan timnya menggunakan analisis ‘multi-omik’ yang ekstensif untuk mengkarakterisasi bakteri. “Kami mengumpulkan data profil metabolik di bawah kondisi [kultur] yang berbeda,” katanya. “Kami juga mengumpulkan data proteomik yang membandingkan sel yang dikodekan ulang dengan beberapa nenek moyang yang berbeda, termasuk sel tipe liar.” Dengan cara ini, mereka secara sistematis mengubah genom hingga sel-sel tersebut dapat tumbuh dalam kondisi kultur standar dengan kecepatan yang kurang lebih sama dengan bakteri yang tidak dimodifikasi – sebuah hasil yang tidak sepele, mengingat pengodean ulang genom sering kali mengganggu pertumbuhan. Nyerges dan rekan-rekannya juga beralih ke multi-omik untuk memecahkan masalah genom 57 kodon mereka. Mereka juga menggunakan strategi eksperimental yang memacu evolusi cepat bakteri dalam kultur, untuk mendorong pemilihan mutasi genom yang meningkatkan kebugaran.
Alat-alat algoritmik juga membantu para peneliti untuk memodelkan dan memprediksi hasil dari beberapa eksperimen penulisan ulang genom sebelumnya. Sebagai contoh, tim ahli biologi sintetis Howard Salis di Pennsylvania State University di University Park menggunakan data kuantitatif dari layar throughput tinggi dari sel yang dimodifikasi secara genetis dan untaian DNA sintetis untuk mengembangkan algoritme yang dapat mendefinisikan, mengkarakterisasi, dan bahkan mendesain urutan yang mengatur proses-proses seperti transkripsi dan translasi. “Sebuah makalah yang biasa kami kerjakan saat ini terdiri dari 10.000 hingga 100.000 eksperimen yang berbeda yang telah didefinisikan dan dirancang,” kata Salis. Hasilnya digunakan untuk mengekstrak prinsip-prinsip fisika yang dapat diuji yang memungkinkan algoritme untuk memprediksi, misalnya, bagaimana perubahan pada urutan promotor gen mengubah ekspresi hilir.
“Anda bisa menguji semuanya,” kata Salis. “Dan kita bisa menggabungkan model-model yang ada untuk merancang eksperimen berikutnya untuk memahami hal-hal yang masih disalahpahami.” Memang, laboratorium Church telah menggunakan beberapa alat Salis untuk merancang mikroba 57 kodon. Nyerges mengatakan bahwa algoritma semacam itu telah menjadi aset penting – meskipun tidak cukup untuk mencegah pemecahan masalah yang cukup besar. “Bahkan perubahan yang sangat kecil pun dapat secara kumulatif menyebabkan masalah kebugaran yang signifikan setelah Anda menambahkan ribuan gen dalam genom,” katanya.
Kemajuan pembuatan bir dalam eukariota
Genom bakteri yang kecil dan mandiri merupakan tempat uji coba yang ideal untuk mengembangkan alat genomik sintetis. Namun, kemajuan luar biasa dari tim Sc2.0 menunjukkan bahwa prestasi serupa dapat dicapai dalam eukariota.
Tidak seperti E. coli, yang memiliki kromosom melingkar tunggal dengan sekitar 5 juta pasangan basa, genom S. cerevisiae mencakup lebih dari 12 juta basa di 16 kromosom linier. Sejak tahun 2011, tim Sc2.0, yang dipimpin oleh ahli genetika Jef Boeke dari New York University, telah secara sistematis mendesain ulang, membangun, dan men-debug versi sintetis dari semua kromosom tersebut. Tujuannya meliputi pengkodean ulang genom untuk membebaskan salah satu dari tiga kodon penghenti untuk penggunaan alternatif; menghapus transposon dan elemen bergerak lainnya; dan memindahkan semua gen yang mengkodekan RNA transfer ke ‘neokromosom’ ke-17.
Selain itu, proyek Sc2.0 menggunakan sistem yang disebut SCRaMbLE, di mana gen ragi yang dianggap tidak penting diapit oleh sekuens DNA yang memungkinkan mereka untuk dipotong dan disusun ulang oleh enzim. SCRaMbLE memungkinkan tim untuk menghasilkan dan menguji varian kromosom yang mengandung berbagai penghapusan gen dan penataan ulang struktur, menyediakan platform untuk pengujian kebugaran. “Dalam bidang teknik, sangat sulit untuk membayangkan membuat satu miliar pesawat dan mencoba menerbangkannya untuk melihat mana yang tidak jatuh,” kata Cai. Namun, para peneliti dapat melakukan hal tersebut dengan ragi, secara sistematis menyelidiki seberapa jauh genom dapat diubah sebelum rusak.
Beberapa tugas rekayasa pada ragi lebih sederhana daripada bakteri – misalnya, genom ragi memiliki lebih sedikit genetik yang berkerumun. “Kami belum melihat bukti adanya gen yang tumpang tindih atau promotor yang tertanam di dalam gen,” kata Boeke. Namun, Cai memperkirakan bahwa dua pertiga dari upaya tim difokuskan pada debugging daripada konstruksi, dan kejutan-kejutan merupakan hal yang biasa terjadi. Boeke mengatakan bahwa banyak tantangan yang muncul akibat anotasi yang buruk dari genom ragi yang awalnya digunakan oleh tim untuk upaya desain mereka. “Setidaknya ada satu kromosom yang memiliki banyak kesalahan di dalamnya,” katanya. Ada juga beberapa kasus di mana penggunaan SCRaMbLE untuk menghapus gen yang tidak penting tanpa disadari telah mengganggu fungsi atau regulasi gen-gen lain di dekatnya yang memiliki peran yang lebih penting di dalam sel.
Tim ini menyempurnakan desainnya dengan menggunakan proses berulang dari siklus rancang-bangun-uji. “Kami menggunakan rekombinasi untuk memungkinkan kami mengganti urutan tipe liar selangkah demi selangkah,” kata Yue Shen, kepala ilmuwan biologi sintetis di BGI Research di Shenzhen, Tiongkok, yang kelompok laboratoriumnya mengerjakan tiga kromosom ragi untuk Sc2.0. Hal ini memungkinkan para peneliti untuk menilai dampak spesifik dari setiap bentangan kromosom yang dikodekan ulang. Secara paralel, para peneliti Sc2.0 menggunakan strategi multi-omik yang serupa dengan yang digunakan pada bakteri untuk mendiagnosis dan memperbaiki masalah kelangsungan hidup dan kesehatan sel.
Namun, Sc2.0 juga bergulat dengan efek kombinatorial yang muncul hanya ketika beberapa kromosom yang ditulis ulang dimasukkan ke dalam sel secara bersamaan. Pada tahun 2023, Boeke dan rekan-rekannya menjelaskan diagnosis dan perbaikan salah satu bug sistem tersebut, yang timbul dari ketidakcocokan yang tak terduga antara kromosom sintetis III dan X – gen yang dimodifikasi pada satu kromosom yang mengganggu penerjemahan gen esensial di kromosom lainnya7. “Kami berharap tidak ada lagi yang seperti itu,” kata Boeke. Sejauh ini, tim telah menggabungkan 7,5 kromosom sintetis dalam satu sel – mewakili lebih dari 50% genom ragi – dan Boeke berharap dapat menyelesaikan proses perakitan untuk seluruh 17 kromosom dalam 6 bulan ke depan.
Di persimpangan jalan
Saat ini, bidang genomik sintetik berada di persimpangan jalan. Sementara banyak peneliti berencana untuk menggali lebih dalam tentang model organisme pilihan mereka, yang lain mengincar medan baru. Kelompok Cai bercita-cita untuk mendesain ulang kromosom manusia dan kentang, misalnya, dan beberapa kelompok sedang merenungkan peluang untuk desain genom bottom-up yang sebenarnya. Salis melihat ini sebagai peluang yang menarik untuk mengembangkan organisme yang dioptimalkan untuk tujuan bioteknologi, memungkinkan kompleksitas yang jauh lebih besar daripada yang mungkin dilakukan hanya dengan mengutak-atik genom yang ada. “Pada dasarnya Anda bisa mengambil yang terbaik dari yang terbaik dari apa yang Anda inginkan – dan yang terpenting, Anda tahu persis apa yang Anda masukkan,” katanya.
Namun, kemajuan akan membutuhkan solusi untuk beberapa tantangan yang mendesak. Salah satunya, biaya sintesis DNA presisi skala besar masih tinggi. Cai memperkirakan bahwa blok bangunan DNA yang disintesis secara komersial hingga 10 kilobasa mungkin memerlukan biaya sekitar $0,10 per basa untuk memproduksinya. Tetapi banyak genom eukariotik mengandung elemen berulang yang sulit untuk disintesis, dan Cai mengatakan bahwa perakitan semua komponen “dapat dengan mudah melipatgandakan biaya bahan awal”. Inilah sebabnya mengapa salah satu inisiatif Shen di BGI Research bertujuan untuk mengembangkan solusi yang dapat diskalakan untuk produksi blok pembangun genom yang efisien8. “Kami berharap untuk genom ragi sintetis berikutnya, kami dapat menyelesaikannya dalam 2 atau 3 tahun, bukan 12 tahun,” katanya.
Algoritma desain yang canggih dengan kekuatan prediksi yang lebih besar dapat memangkas biaya ini dengan menghasilkan cetak biru genom yang lebih akurat yang merampingkan proses pengujian dan optimasi. Sebagai contoh, beberapa kelompok telah menunjukkan potensi kecerdasan buatan (AI) generatif untuk membangun molekul DNA fungsional yang didasarkan pada pola yang dipelajari dari kumpulan data urutan yang sangat banyak. Namun, Salis berhati-hati agar tidak terlalu bergantung pada AI: “Ini bukan sains lagi – ini benar-benar kotak hitam.” Sebaliknya, ia berharap untuk melihat kemajuan dalam membangun model pembelajaran mesin mekanistik yang dilatih dengan eksperimen yang didefinisikan dengan baik dan dianotasi dengan cermat. Namun, ini adalah proses yang lambat dan mahal, dan Salis memperkirakan bahwa model untuk genom eukariotik yang kompleks “mungkin sekitar 25 tahun di belakang” model mikroba yang setara.
Meski begitu, peluang masih terbuka lebar. Cai membandingkan kecanggihan biologi sintetis dengan awal mula terjun ke dunia pengkodean komputer. “Pada masa-masa awal, Anda hanya akan mencoba menulis aplikasi dan mengompilasinya dan berharap tidak ada kesalahan,” katanya. “Namun, saya rasa setelah Anda melewati tahap pertama ‘halo dunia’, tahap selanjutnya akan lebih didorong oleh niat.”
